A separação de moléculas carregadas em um campo elétrico é denominada como eletroforese. Essa técnica é um procedimento básico e essencial para qualquer laboratório. De acordo com o tamanho, forma e carga as moléculas são separadas uma das outras por meio da eletroforese.
O método mais utilizado para a separação dos fragmentos de DNA é a eletroforese através do gel de agarose, matriz na qual é aplicada a amostra, permitindo realizar a separação dessas moléculas. Esse procedimento é usado como método analítico e preparativo, pois depois de separar as moléculas de DNA, um fragmento específico pode ser extraído do gel para posteriormente ser utilizado em diversos procedimentos, a partir de técnicas de manipulação genética.
A Agarose é um polissacarídeo, neutro extraído da parede celular de determinadas algas, que dissolve em água fervente e quando esfria sua estrutura fica parecida com uma gelatina. Quimicamente falando, sua estrutura permite a formação de gel altamente resistente, mesmo em baixas concentrações. O gel possui uma estrutura macrorreticular (com aspecto de rede, formando malhas), que pode ser ajustada simplesmente pela variação da concentração de agarose (quanto mais alta a concentração, menor o tamanho dos poros). Isso permite a passagem das moléculas, atuando como peneiras moleculares e fornece as condições ideais para a realização da eletroforese.
Quando há baixa porcentagem de agarose no gel, é relativamente fácil de ser manipulando, sendo indicado para separar moléculas grandes como DNA e RNA, proteínas e alguns complexos proteicos. Os fragmentos de DNA menores podem migrar através de um gel de agarose mais rapidamente que os fragmentos maiores.
O preparo do gel de agarose
Vale lembrar que o gel deve ser preparado de acordo com o tamanho da molécula que será estudada. A seguir, você pode analisar a concentração de 2,5% porém você pode modificar a quantidade de agarose a ser pesada de acordo com o necessário (por ex.: para gel 1,5% pesar apenas 1,5 g).
Reagentes e materiais
- Preparo de 100 ml de gel de agarose 2,5%
- EPI’s (Equipamento de Proteção Individual)
- 2, 5g de agarose pulverizada
- 100 ml TBE 1X
- brometo de etídeo /corante safer
- Proveta graduada de 100 ml
- Barca de pesagemou papel manteiga para pesagem
- Espátula
- Balão volumétrico de 500 ml
- Luva de pano emborrachada
Equipamentos
- Balança analítica
- Micro-ondas
- Cuba horizontal para eletroforese
Passo a passo
- Antes de tudo, é preciso se vestir de maneira adequada para o procedimento.
- Agora é preciso ligar e equilibrar a balança. Para pesar a agarose, conte com a ajuda da barca, copo ou papel manteiga.
- Será preciso colocar 100 ml de TBE 1x em um balão volumétrico, para isso utilize uma proveta. Depois, adicione a agarose pesada e homogeneizada.
- Aqueça no micro-ondas a solução até a total dissolução, sem bolhas.
- Adicione, com uma micropipeta, 5 uL de brometo de etídeo no gel e deixe uniforme.
- Em cada cuba, despeje 30 ml do gel.
- Colocar o suporte com os pentes próprios que servirão como molde para produzir as cavidades no gel;
- Aguardar o gel endurecer. Ao esfriar, a agarose fica com aspecto turvo e com resistência diretamente proporcional à concentração de agarose utilizada.
- Com cuidado para não danificar a matriz do gel, os pentes devem ser retirados.
- Por fim, o gel de agarose é colocado no interior da cuba de eletroforese horizontal ou estocado em geladeira imerso em tampão TBE 1X.
- Para que aconteça a visualização de maneira correta, os géis são corados utilizando corante na amostra ou durante a preparação do gel.
Problema possível
É preciso se atentar a inutilidade do gel. Ele é considerado inviável quando forma bolhas que não foram retiradas durante o aquecimento ou ainda, quando o processo de polimerização ultrapassar 20 minutos.
O gel de agarose deve ficar homogêneo e translúcido e sua polimerização se dá em torno de 10 minutos.
Resultados
A funcionalidade do gel de agarose é visualizada por meio de uma corrida eletroforética, onde são analisados os padrões das bandas de DNA amplificado.
