Criada por Kary Banks Mullis, em 1983, a técnica PCR (Polymerase Chain Reaction ou Reação em Cadeia da Polimerase) é usada para amplificar “in vitro” uma região específica de DNA. Este método é utilizado para produzir diversas cópias de uma determinada parte do DNA para diferentes análises.
A aplicação é ampla, por exemplos, nas clínicas, para fins diagnósticos; na identificação de seres vivos ou mortos, a partir de amostras mínimas de tecido (fio de cabelo, gota de sangue etc.) e em biotecnologia.
Etapas do processo de PCR
- Desnaturação: a separação da dupla fita de DNA ocorre em temperatura de 95ºC.
- Hibridização: nesta etapa a temperatura pode variar entre 60 e 64ºC. Os primers fazem a ligação com as sequências complementares da região que se pretende amplificar do DNA. Eles servem como indicadores para a enzima polimerase.
- Polimerização: este processo deve ser iniciado com a temperatura de 72ºC. A tag polimerase liga-se a fita sinalizada pelo primer, complementando-a, e inicia a sequência que será replicada, formando novamente uma fita dupla de DNA.
Este ciclo é realizado cerca de 40 a 60 vezes promovendo a amplificação de determinada região que se pretende analisar.
qPCR ou PCR em Tempo Real
Considerada uma variação da técnica convencional de PCR, a PCR em Tempo Real (Real Time Quantitative PCR) permite que a amplificação e detecção ocorram simultaneamente. A tecnologia qPCR apresenta excelentes vantagens e por isso é mais utilizada se comparada aos métodos convencionais.
Por meio dela é possível visualizar o resultado, em tempo real, durante o procedimento de amplificação, o processo é rápido, o risco de contaminação é baixo e ainda é capaz de gerar resultados quantitativos com maior precisão.
Durante a amplificação, a quantificação é determinada pela quantidade de produto amplificado durante cada ciclo, através da fluorescência emitida. Esta metodologia utiliza um equipamento com sistema de monitoramento da emissão da fluorescência
Para que os resultados sejam precisos é necessário utilizar equipamentos confiáveis, com propriedades óticas específicas para que o aparelho não interfira na emissão ou leitura da fluorescência. Se algum problema acontecer neste cenário, o resultado sairá errado.
